磁性材料在酶固定化领域的应用研究进展-辽宁化工2022年02期

摘      要：与化学催化相比，游离酶作为生物催化剂，以独特的性质使生物酶的工业化得到快速发展。但是游离酶在工业生产时有诸多的不足，比如稳定性差、无法重复利用、不易保存、自动化生产难度高等。因此，固定化酶技术的出现加快了酶催化领域的发展。近年来，人们从多学科交叉的角度提出以磁性材料为载体固定酶制剂的固定化方法，利用高效、易分离、重复利用率高等优势研发出新型的功能化磁性固定化酶材料，提高了酶催化效率，使该领域日益受到广泛的关注。对应用于酶固定化的磁性材料合成、磁性材料固定化酶进行全面的综述，并扼要对其各自特点进行了比较，最后介绍了磁性固定化酶的应用。

关  键  词：固定化酶;固定化方法;磁性载体材料;固定化酶的应用

中图分类号：TQ426.97     文献标识码： A     文章编号：1004-0935（2022）02-0251-04

生物酶催化高效且单一性强，于温和的反应条件下即可发生生物催化作用。但是游离态酶的稳定性较差，活性保存时间短，在工业生产中无法多次使用，因此酶固定化作为重要的生物工程技术快速发展起来。固定化酶技术是指将游离的酶通过相应方法固定在一定空间或不溶性载体上，进而限制游离酶自由运动，并能保持酶的生物结构和活性的完整性，使酶能够长时期发挥催化作用，并且可以重复利用的生物工程技术[1]。固定化酶技术早在1916年由Nelosn和Griffin等建立，他们发现蔗糖酶吸附到骨炭微粒后仍与游离酶的催化活性一致[2]，并初步提出了固定化酶的思想。到2fdb9b866cbeef3c265a1f328d4c5ca3b0世纪60年代末，千烟一郎等通过固定化酰化氨基水解酶拆分了氨基酸旋光异构体，并成功实现了该技术的工业化[3]，随后固定化酶技术进入了飞速发展的阶段。传统的固定化材料存在固定化效率低下，固定化方式造成固定化酶活性降低等不足之处，因此，新型的固定化材料及合成技术不断涌现，并成为研究热点，其中磁性载体材料因制备简便、成本低、性质稳定、可控性好、易于分离回收等特点，作为新型载体应用于固定化酶，并成为近些年快速发展的新方向。本文对磁性载体材料合成方法和磁性固定化酶应用的两方面进行了综述。

1 磁性材料的制备

磁性材料在生产生活中应用广泛，在现代科技和工业领域，特别是在电气工程领域中发挥着重要作用。磁性材料种类很多，其中Fe3O4颗粒因制备方法比较简单、成本低、毒性小、结构和功能的可预期性、易于调控等优点而被大力发展[4]。相对于高分子材料，磁性材料对生物酶具有较好的吸附性能，对生物酶的捕集能力强，诸多官能团如巯基（—SH）、氨基（—NH2）、羧基（—COOH）、磺酸基（—SO3H）、羟基（—OH）等均可以被用于吸附材料的改性。以上的活性基团对生物酶具有很强的固定化作用，通过改性后的磁性材料可有效地选择性吸附生物酶形成固定化酶。磁性材料制备方法主要有物理法和化学法，其中物理法又可分为研磨法、包埋法、超声波沉淀法等;化学法可分为共价沉淀法、水热法、溶胶-凝胶法、快速燃烧法等[5-7]等。

1.1  物理法

1.1.1  研磨法

Papell首先提出了研磨法[8-9]，在该法中，首先将合金按照一定比例进行机械混合，再加入适量无水乙醇等有机试剂形成浆料，通过研磨将合金制成粗颗粒，经长时间球磨后进行浓缩得到非晶粉，然后在一定的条件下结晶得到磁性材料。在该研磨法基础上成功地制备了庚烷、油酸和粉状磁铁矿的磁性胶体以及其他磁性液体复合材料。研磨法具有制备技术简单的特点，但其制备时间长、成本高、材料使用效率低，材料中杂质过多，获得高浓度的磁体较为困难，因此使用性能不佳。

1.1.2  超声波沉淀法

该方法是利用超声波的机械扰动合成磁流体。当超声波能量达到一定程度时， 就会产生“超声空化”现象， 即溶液中气泡在声场作用下产生的一系列动力学过程，当足够强度的超声波通过液体时，在声波负压半周期的声压幅值超过液体内部静压强时，存在于液体中的微小气泡形成“空化核”，并迅速增大[10]， 能得到粒径均一稳定的磁性粒子。研究表明，随着超声频率的增加，粒径减小，比表面积增大，晶面的衍射强度较小[10]。Sivarajan[11]等以Al2（SO4）3-尿素-水为研究体系，研究了超声波对磁粒的粒径、形状的影响。超声波能有效防止颗粒聚集，从而促进新晶相的形成。通过超声波沉淀法获得的磁粒具有很好的结构特性和磁性。

1.1.3  包埋法

此法运用机械搅拌、超声分散等方法使磁性颗粒均匀悬浮在溶液中，利用范德华力、共价键或氢键等作用，使磁性颗粒均匀分布在天然或者合成聚合物中[12]，然后经过乳化等处理过程，可在磁性粒子表面形成高分子壳层。为增加磁粒的稳定性，使用交联剂对高分子壳层进行稳定化处理。安小宁[13]等采用壳聚糖包埋磁粉，经戊二醛修饰、环氧氯丙烷交联制得高磁性壳聚糖微粒，应用于胰蛋白酶的亲和纯化，但粒径不均一且不呈球形。利用该法的优点是制备操作简便，易于进行，磁粒表面官能团不易损失。缺点是无法有效的控制磁性材料的粒径，磁性颗粒分布宽，并且形成的磁粒的结构不规则。

1.2 化学法

1.2.1  共价沉淀法

共价沉淀法[14]是合成磁性材料的一种简便且有效经济的一种方法，该方法首先将含有Fe2+和Fe3+混合溶液与氨水进行反应，然后经干燥脱水，得到了不溶于水的Fe3O4磁粒。由于Fe3O4磁粒化学性质不稳定，需要加入沉淀剂保护磁粒防止其变性，并需要氮气保护。杨玉东使用该法，通过氮气保护下，在碱性条件下，将氯化铁和氯化亚铁均匀混合制备得到粒径5 nm的磁性粒子[15]。最后将Fe3O4磁粒与表面活化剂充分反应获得铁氧体磁性液体。该方法操作简单、反应时间短、制备成本低，适用于大规模工业化生产，但是在制备中磁性材料的粒径不易控制，粒径分布不均匀，磁体中容易引入一定的杂质。

1.2.2  水热法

水热法也称热液法，反应需在特定的反应釜中进行，通过加热在密闭的容器中产生一个高温高压的环境制备材料的方法，使不溶物质开始溶解并且重新结晶，即加热重结晶。Mizutani等制备了粒径均匀的磁性颗粒，是在初始溶液里加入硫酸盐来调节粒径的尺寸。粒径大小根据溶剂的浓度而变化，范围在9.5～38.6 nm之间[16]。该法制备磁性材料工艺简单，无须高温煅烧，可以得到的产物纯度高、粒径均匀。但由于反应容器需要使用耐高温高压的材料，在一定程度影响了应用前景。

1.2.3  溶胶-凝胶法

溶胶-凝胶法[17]是后期发展起来的代替高温固相合成反应陶瓷、玻璃和固体材料的一种方法。该方法是将易于水解的金属醇盐或无机盐等化合物与水发生反应，经水解与缩聚反应 逐渐凝胶化，在进一步干燥烧结等处理后得到氧化物或其他化合物的晶形薄膜。Sarah[18]等用该法制备了多晶铁氧体，经均匀混合后制成复核材料，磁粒的磁性与BaTiO3含量的增加而减弱。该法工艺流程简单、产物粒径小且均匀，易于制备较大面积的薄膜，原料成本低，但是实验周期长，在凝胶时容易裂开，有机试剂易挥发，对人体有一定毒副作用，且该方法易受到反应环境影响。

1.2.3  快速燃烧法

该法也称溶液燃烧法，是一种新兴的制备磁性材料的方法，该法是铁盐和有机铁盐均匀溶解在可燃的有机溶剂中，点燃溶剂燃烧至熄灭，然后按一定的反应条件下煅烧形成磁性材料。Dinesha[19]等制备了Co和ZnO纳米磁性材料，具有结构发达，磁性材料的磁性随温度上升而提高，随Co含量上升而下降。该法优点是不需添加助溶剂，也无须洗涤，制备简便且周期短，材料成本低，适用于工业化生产，通过调控反应条件可以控制磁性材料的粒径[20]。

2  磁性材料固定化酶的应用

2.1  阿魏酸酯酶固定化应用

阿魏酸酯酶[21]在工业中的应用非常广泛，主要用于水解植物细胞壁中半纤维素间、半纤维素与木质素之间的阿魏脂键，如在造纸行业中使用阿魏酸酯酶可减少制浆的化学药品用量，还可提高纸品的机械强度。另一重要应用是用来制备食品医药领域中的抗氧化剂——阿魏酸，如果在工业生产中一次性投放阿魏酸脂酶，则无法回收，造成不必要的浪费。与游离酶相比，磁性材料固定化的阿魏酸酯酶在重复使用3次后的酶活仍保持85%，7次使用后保留有35.54%的酶活。酶经过固定化之后各项性质均得到了提高，并且磁性固定化阿魏酸酯酶能够非常快捷地从反应体系中回收重复使用。

2.2  磁性材料固定化脂肪酶的应用

生物柴油是以油料作物、餐饮垃圾油等油脂原料通过酯交换或热化学工艺得到的脂肪酸单酯，是极具前景的可替代石化柴油的再生性柴油燃料[22]。因反应条件温和、对环境影响小等优点，生物酶法是合成生产生物柴油的主流方法。其中脂肪酶是合成生物柴油的生物催化剂[23]，研究表明固定化脂肪酶具有稳定性高、反应在室温下进行、工业成本低、催化效率高等优势。张宇等采用磁性纳米Fe3O4材料固定化脂肪酶在最优反应条件下制备生物柴油，结果表明酯转换率达到86.69%[24]，进一步证明了磁性材料固定化脂肪酶在生物柴油产业化过程中的发展潜力。

2.3  在有机废水处理上的应用

随着现代工农业生产的快速发展，工业废物等伴生的各种有机污染物不断进入环境水体中，漆酶可以有效降解水体中苯酚和芳香胺等有机污染物，固定化漆酶在工业利用过程中要比游离态漆酶的使用时间更长，稳定性更高，耐受性更强，是一种高效催化剂，并且价格低廉，来源广泛，因此被大规模的应用在工业废水处理中，尤其应用于食品工业废水处理中，处理后的废水明显得到改善。王苗苗等将介孔SiO2/ Fe3O4磁性中空微球当载体，运用物理吸附进行固定化漆酶，吸附3 h后，对漆酶的有效固定化量达到689 mg·g-1，以此固定化酶处理浓度为10 mg·g-1的2，4-二氯化酚水溶液，6 h之后固定化漆酶对其去除率达到81.6%[25]，表现出优良的分离和重复利用的特性。

2.4  磁性材料固定化乳糖酶应用

乳糖酶是一种无味、绿色的生物酶，广泛存在动植物及微生物体内[26]。在全球范围内70%的成人缺乏肠道乳糖酶，该酶把乳糖在一定条件下分

解 [27]。磁性固定化乳糖酶的反应温度和pH范围一定程度上大于游离态酶，并且具有便于从反应体系中回收、乳糖酶的活性保持率高等优势，固定化酶反复使用5次后酶活仍保持了65%，磁性材料固定化乳糖酶在活力及稳定性上有所提升[28]。

3  总结和展望

生物酶在现代工业中起着至关重要的作用，游离酶的在工业生产中出现的各种问题，致使固定化酶应运而生，并使生物酶工程快速发展。因此在生物医学、食品行业、环境工程中具有广泛的应用前景。磁性材料固定化酶在反应过程中保持了较高稳定性和酶活性，利用磁性载体，在酶催化反应中引入磁场，能够改变固定化酶的方向，可以进一步提高固定化酶的降解效率，同时便于反应体系中固定化酶的分离，回收后的固定化酶可反复使用，降低了酶催化成本。在固定化技术中，磁性酶催化正形成一个新的领域。

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Research Progress in Application of Magnetic Materials

in Enzyme Immobilization

WANG Dong-xv， LIU Bei-xi， YE Hui-min， GAO Yue， YU An-hong， ZHANG Ying， KONG Liang*

（College of Marine Technology and Environment， Dalian Ocean University， Dalian Liaoning 116023， China）

Abstract：  Compared with chemical catalysts， free enzymes have developed rapidly in industry because of their unique advantages. However， free enzymes have many deficiencies in industrial production， such as poor stability， non-reuse， difficult preservation， poor automatic production level. Therefore， the immobilized enzyme technology has accelerated the development of enzyme catalysis. Recently， the method of immobilizing enzyme with magnetic carrier material was proposed based on the interdisciplinary. Using the advantages of high efficiency， easy separation and high reuse rate， many new functional magnetic immobilized enzyme materials have been developed to improve the enzyme catalytic efficiency. It has become one of the research hotspots in the field of immobilized enzymes. In this paper， the synthesis of magnetic materials for enzyme immobilization and the methods of enzyme immobilization by magnetic materials were comprehensively reviewed， and their characteristics were briefly compared. Finally， the application of magnetic immobilized enzyme was introduced.

Key words：  Immobilized enzyme; Immobilization method; Magnetic carrier material; Application of enzyme immobilization